外泌體樣本收集

    外泌體是由細胞分泌的納米級膜性小囊泡，直徑約30~150nm。外泌體來源多樣，廣泛存在并分布于各種生物液體中，富含來源細胞的蛋白質、脂質和核酸，參與細胞間的信息交流。不同病理和生理條件下，外泌體的內容物不盡相同，因此外泌體可以很好地反映生物體的疾病與健康狀態。此外，外泌體特殊的膜結構能夠保護其內容物如RNA（microRNA、mRNA、lncRNA、circRNA）免受酶的降解，保證其能在各類體液中被穩定檢測到，因此外泌體是研究各種疾病的良好生物學材料，可作為腫瘤潛在的biomarker和治療靶點，亦可作為基因/藥物的遞送載體，在疾病的診斷和治療方面具有廣闊的應用前景。

據統計，2019年國自然中標的外泌體相關項目總計600多項，總金額高達2.5億，相較2018年，總金額增長了44.5%，足可見外泌體研究的火熱程度。近幾年，隨著高通量檢測技術的飛速發展，對外泌體進行組學研究極大地推動了外泌體的研究進展。伯豪生物致力于科研服務，擁有高標準的樣品處理平臺、微陣列芯片平臺、高通量測序平臺、生物標志物平臺、生物信息分析平臺等多個平臺，能夠實現外泌體分離、鑒定、內含物（蛋白質、mRNA、ncRNA）檢測及驗證的“一站式”外泌體研究服務。

那么如何開展外泌體研究，第一步也是相當重要的一步就是收集外泌體含量高的樣本。外泌體存在于各種生物體液中，如血液、乳汁、尿液，腦脊液，那么如何有效的收集各種類型的樣本用于后續的外泌體分離呢，下面我們來簡單介紹下各類型外泌體樣本的具體收集方法。

注意：收集血清樣本時一定不能加入抗凝劑。

1) 采集外周血（建議早晨空腹抽血），迅速轉入不含EDTA的試管中；

2) 室溫（22℃~25℃）下靜置30分鐘，或4℃下靜置3~4小時，可見自行凝固；

3) 吸取上清至新的離心管中，4℃，8200×g離心10分鐘；

4) 吸取上清至新的離心管中，4℃，16000×g離心10分鐘；

5) 小心吸取上清至新的離心管中（1.5ml離心管，每管不超過1ml）， -80℃保存；

6）干冰寄送樣本。

提示：建議送樣量5 mL 以上（大致需全血8-10mL）

血漿

注意：收集血漿樣本用于RNA研究時一定不要用肝素抗凝管。

1) 采集外周血（建議早晨空腹抽血），迅速轉入EDTA抗凝管中，渦旋或顛倒混合5～10 次；

2) 在1小時（室溫）或2小時（4℃）內進行血漿分離，8200×g離心10分鐘；

3) 吸取上清至新的離心管中，4℃，16000×g離心10分鐘；

4) 小心吸取上清至新的離心管中（1.5ml離心管，每管不超過1ml），-80℃保存；

5）干冰寄送樣本。

提示：建議送樣量5 mL以上（大致需全血8-10mL）

Tips: 血液樣本外泌體研究血清好還是血漿好？

血漿=血液-血細胞；血清=血漿-纖維蛋白原-凝血因子；血清是血液凝固之后收集的液體，在凝血過程中血小板會分泌大量的外泌體，有研究發現血清中有接近50%的外泌體來自額外的分泌，所以一般實驗會選擇血漿。在特殊情況下，如研究與血小板相關疾病的時候，血清比血漿更適合。此外，在采血后最好盡快處理樣本，因血液收集到收集管后，血細胞和血小板會繼續分泌外泌體

細胞上清

注意：細胞培養基必須使用去除外泌體的血清或者無血清培養基

1) 正常含有血清的培養基中培養細胞24h左右，貼壁細胞密度達到70%~80%，懸浮細胞密度達到60%~70%；

2) 將原有血清培養基更換為去除外泌體的血清或者無血清培養基（貼壁細胞直接去除原有培養基，加入適量PBS緩沖液沖洗一次，更換新的培養基；懸浮細胞4℃，300×g離心10分鐘，收集細胞后，加入適量PBS緩沖液沖洗一次，更換新的培養基）繼續培養；

3) 培養48-72小時后，根據細胞數量確定收取上清時間；

4) 4℃，300×g，離心10分鐘收集細胞上清；

5) 4℃，3000×g，離心15分鐘，確保將細胞及細胞碎片去除干凈；

6) 吸取上清，-80℃保存；

7）干冰寄送樣本。

提示：送樣量最好在50 mL 以上，不少于30ml

尿液

1) 收集清晨第一次尿液50ml，注意避免細菌污染，收集前注意飲食控制，前一晚22:00后禁食禁水；

2) 4 ℃ ，3000×g，離心15分鐘，去除細胞或細胞碎片；

3) 收集上清尿液分裝轉移至15ml離心管中，-80℃保存；

4）干冰寄送樣本。

提示：送樣量最好在50 mL 以上

腦脊液

1) 收集腦脊液，收集過程中避免血液污染；

2) 3000×g，離心15分鐘，去除細胞或細胞碎片；

3) 收集上清，-80℃冰箱中保存；

4）干冰寄送樣本。

提示：送樣量最好在20 mL 以上

注：以上建議的送樣量綜合考慮了外泌體的表征檢測（TEM、NTA、WB）和組學研究（轉錄組、蛋白質組）的樣本需求量。上述細胞上清送樣量主要指常規腫瘤細胞，對于其他類型細胞，最好在送樣前進行預實驗，以確定外泌體含量。

目前外泌體的分離方法中應用廣泛的是超速離心法和試劑盒抽提法，超速離心法是外泌體分離的金標準，是高分文章常用的分離方法，獲得的外泌體純度高。其原理主要是依據外泌體與其他微小囊泡密度和大小的不同而分離，通過逐步提高離心速度，有效去除細胞、細胞碎片和大囊泡，收集高純度的外泌體。外泌體抽提試劑盒分離外泌體省時省力，外泌體純度高，SBI外泌體抽提試劑盒，樣本需求量少，最少可從100ul血清或5ml細胞上清中分離外泌體。利用超離或試劑盒法分離獲得的外泌體，經表征檢測確定后即可進行后續的組學研究。

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