如何確認(rèn)細(xì)胞交叉污染

交叉污染雖不如微生物污染普遍，但與HELA細(xì)胞及其他生長迅速的細(xì)胞系間廣泛的交叉污染是個明確的問題，會造成嚴(yán)重后果。

從聲譽好的細(xì)胞庫獲取細(xì)胞系、定期檢查細(xì)胞系性質(zhì)及采用良好的無菌技術(shù)有助于避免交叉污染。

通過DNA指紋圖譜、核型分析和同位素分析可確認(rèn)有無交叉污染。

血清與培養(yǎng)基

通常血清的添加比例為10%，當(dāng)然也可根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)和生長速率適當(dāng)增加或減少添加比例。在更換血清品牌或者批次時，最好需對血清的品質(zhì)進行驗證，防止對實驗造成影響。

對于培養(yǎng)基，目前商品化的比較成熟，穩(wěn)定性也較好。如若需自配培養(yǎng)基時，過濾前攪拌時間不宜過長（培養(yǎng)基中營養(yǎng)豐富，細(xì)菌常溫下20min就可繁殖一代，其代謝產(chǎn)物會對培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶

目前商品化的細(xì)胞培養(yǎng)瓶主要為瓶蓋是否帶氣孔兩種。其中不帶透氣孔細(xì)胞培養(yǎng)瓶擰緊后需適當(dāng)回旋瓶蓋，保證CO2能順利進入細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

細(xì)胞培養(yǎng)過程中，對于適應(yīng)能力強的腫瘤細(xì)胞，可在傳代3-4次后更換新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶。對于非腫瘤細(xì)胞系如293T，HEK293等細(xì)胞，建議每次傳代更換新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶來保證細(xì)胞狀態(tài)。

細(xì)胞傳代

正常細(xì)胞形態(tài)較好，輪廓清晰，邊緣透亮，細(xì)胞增殖狀況良好。當(dāng)貼壁細(xì)胞長到密度90%時，需進行傳代。

傳代時通常使用胰酶消化法。該方法又分為干消化法和濕消化法。

干消化法：胰酶浸潤后棄去胰酶，待細(xì)胞變圓后加入新鮮培養(yǎng)基吹下后再進行細(xì)胞傳代。

濕消化法：待細(xì)胞變圓，肉眼觀察下成流沙狀脫落時即可加入新鮮培養(yǎng)基終止消化，1000rpm離心5min,棄去上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸傳代。

吹打細(xì)胞時，手法要輕柔，避免吹打出氣泡，造成細(xì)胞因內(nèi)外壓差破裂，同時需避免刮到壁影響細(xì)胞的貼壁。

不同細(xì)胞的貼壁能力不同，消化時間不同；不同細(xì)胞細(xì)胞間連接強度不一樣，消化時間不同；同一細(xì)胞生長狀狀況不同，消化時間不同。消化時適時觀察細(xì)胞形態(tài)，避免因過度消化影響細(xì)胞活性。

傳代間隔時間和傳代比例因細(xì)胞而異。細(xì)胞傳代過程中，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)狀態(tài)不好或者污染時及時棄去細(xì)胞，重新復(fù)蘇。

細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

當(dāng)細(xì)胞生長狀況較好或者代數(shù)較早時，需及時大量的凍存。

細(xì)胞凍存液比例為培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1，也可血清：DMSO=9:1。細(xì)胞凍存密度通常為1-3×106個/ml。細(xì)胞凍存采用慢凍方式，減少冰晶形成，避免細(xì)胞損傷。通常4℃放置0.5 h，-20℃放置2 h，-80℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。

細(xì)胞復(fù)蘇時升溫要快，防止在解凍過程中水分進入細(xì)胞，形成冰晶，影響細(xì)胞存活。38℃水浴不時搖動，在1分鐘內(nèi)使其*融化，1000rpm離心5min,棄去上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸移入培養(yǎng)瓶中。

用真誠感動細(xì)胞

俗話說，心誠則靈。對待細(xì)胞培養(yǎng)也應(yīng)如此，“自己要用的細(xì)胞自己養(yǎng)"，多去觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。