體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)及操作步驟

1、瘤細(xì)胞懸液接種

（1）無(wú)菌選取生長(zhǎng)良好(有光澤，淡紅色)瘤組織或?qū)?shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)瘤細(xì)胞。

（2）在PBS中將瘤組織剪碎后用勻漿器研磨，經(jīng)80～100目篩網(wǎng)過(guò)濾成細(xì)胞懸液。

（3）培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)用PBS洗兩遍。

（4）計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至107～108／ml。

（5）常規(guī)消毒后，于接種部位(通常為背部或腋窩腹股溝皮下)用醫(yī)用注射器皮下潛行一段后注入細(xì)胞懸液(0.1ml／部位，＞106細(xì)胞)。初次接種成功率低，細(xì)胞數(shù)盡可能多一些。

（6）次日注意觀察動(dòng)物一般情況。初次接種一般有一段較長(zhǎng)的潛伏期，以后隨著傳代潛伏期逐漸縮短，最后固定為一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的時(shí)間。

2、腹水瘤的建立與腹水瘤的接種　將實(shí)體瘤細(xì)胞直接種于小鼠腹腔、腹壁或其他部位，引起腹水，腹水中含有瘤細(xì)胞，將這種腹水反復(fù)傳代，即可成為腹水瘤。初次傳代時(shí)，腹水常呈血性(含大量紅細(xì)胞)，反復(fù)傳代后腹水逐漸變成乳白色。腹水瘤的接種過(guò)程如下。

（1）將凍存或培養(yǎng)的腹水瘤細(xì)胞離心和洗滌，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

（2）消毒動(dòng)物，左下腹穿刺接種106腹水瘤細(xì)胞。

（3）接種腹水瘤細(xì)胞后約7~12d，待小鼠腹部明顯膨大。用碘酒棉球消毒小鼠腹部，用9號(hào)針頭抽取腹水，也可行腹部解剖后，用滴管吸取。每只小鼠可抽3~5ml。

（4）抽取的腹水經(jīng)3000rpm離心15min，收集上清，分裝凍存?zhèn)溆谩?/span>

1、凍存細(xì)胞：

（1）選對(duì)數(shù)增生期細(xì)胞(證明無(wú)支原體污染)，在凍存前1d換液。

（2）按常規(guī)方法把培養(yǎng)細(xì)胞制備成懸液，計(jì)數(shù)，使細(xì)胞密度達(dá)5×107／ml左右密度，離心，去上清。

（3）加入配制好的凍存液（培養(yǎng)液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO3 0.1ml），按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細(xì)胞重懸。凍存細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑10％二甲基亞砜(DMSO) 或甘油，可使冰點(diǎn)降低，使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外。

（4）分裝于無(wú)菌凍存管中，每管加1.5m懸液。

（5）旋好凍存管并仔細(xì)檢查，一定要蓋緊，做好標(biāo)記。

（6）凍存：在特殊的儀器或簡(jiǎn)易的液氮容器中，按-1℃／min的速度，在30～40min時(shí)間內(nèi)，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。要適當(dāng)掌握下降冷凍速度，過(guò)快能影響細(xì)胞內(nèi)水分透出，太慢則促進(jìn)冰晶形成。

操作時(shí)應(yīng)戴防護(hù)眼鏡和手套，以免液氮凍傷。

2、復(fù)蘇細(xì)胞：

（1）從罐中取出凍存管。

（2）迅速放入36℃～37℃水浴，不時(shí)搖動(dòng)，使其急速融化，30～60s內(nèi)完成。

（3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后，打開(kāi)蓋子，用吸管將細(xì)胞懸液注入離心管中，再滴加10ml培養(yǎng)液。

（4）低速離心(500～1000r／min) 5min，去上清后再用培養(yǎng)液洗一次。

（5）用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，裝入培養(yǎng)瓶37℃培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后，繼續(xù)培養(yǎng)。以后仍按常規(guī)進(jìn)行培養(yǎng)。

凍存細(xì)胞數(shù)量要充分，密度應(yīng)達(dá)到107／ml，在融后稀釋20倍時(shí)，仍能保持5×105／ml數(shù)量。