類器官培養基操作指南（以肝癌為例）

貨號：WS010-100-KIT

品牌：WinSera

規格：100ml

操作步驟：
1、 原代

(1)取材后的肝癌組織須在 2 - 8℃含有組織保存液E的取樣瓶中，快速轉運至潔凈實驗室進行組織處理和干細胞分離，拍照并登記信息。

(2)準備若干培養皿，加入 4℃預冷的肝癌類器官培養緩沖液 B備用

(3)取樣瓶消毒，將組織放入培養皿中，利用肝癌類器官培養緩沖液B清洗三次后，利用眼科剪或手術刀將腫瘤組織剪切成體積約為 1~3 mm3 的組織塊。

(4)組織用肝癌原代組織消化液C消化，37℃震蕩消化10-20 min，（消化過程中隨時觀察消化情況）。

(5)取少量液體在顯微鏡下觀察，鏡下觀察到較多的單個細胞或 70μ m 以下的細胞簇后，加入三倍體積肝癌類器官培養緩沖液B終止消化。

(6)使用100μm孔徑的篩網進行過濾，將濾液收集后，于300g富集離心5min后移去上清，添加肝癌類器官培養緩沖液B重新重懸離心。

(7)基質膠計算：第6步后觀察收集到的組織體積，添加25倍組織體積的基質膠重懸鋪板。

(8)24孔細胞培養板為例，每孔點膠25ul組織基質膠混合物進行鋪板（4℃下操作）。

(9)將鋪好的培養板放入37℃培養箱中10-15min成膠，添加肝癌類器官培養基A（恢復室溫）進行培養。

2、 類器官傳代培養

(1)移液器吸去培養基，每孔添加1-2ml 4℃類器官緩沖液B放置2min。

(2)移液搶輕柔吹打基質膠，收集在15ml離心管中，4℃靜置10min。（每6-8孔為一組）

(3): 3.1類器官數量不足或體積較小時： 離心5min棄去上清，添加適量肝癌類器官緩沖液B重懸移入1.5ml離心管，300g離心5min棄去液體進行第4步。 3.2類器官數量較多或體積較大時：離心5min棄去上清，添加適量類器官傳代消化液D消化2-3min，添加肝癌類器官緩沖液B終止消化，離心5min棄去混合液，添加適量肝癌類器官緩沖液B重懸移入1.5ml離心管，300g離心5min棄去液體進行第4步。

(4)類器官收集后，添加基質膠重懸，每孔25μl基質膠鋪在24孔細胞培養板中，放置培養箱中10-15min添加500μl肝癌類器官培養基A。

3、類器官凍存

(1)移液器吸去培養基，每孔添加1-2ml 4℃類器官緩沖液B放置2min。

(2)移液搶輕柔吹打基質膠，收集在15ml離心管中，4℃靜置10min。（每6-8孔為一組）

(3) 離心5min棄去上清，添加適量肝癌類器官緩沖液B再次重懸，300g離心5min棄去液體。

(4)添加適量類器官凍存液 F，輕柔吹打重懸，以24孔細胞培養板為例：密度為2個孔凍存1管，每管體積1.4ml。

(5)做好標記信息，進行程序降溫后，移入液氮長期保存，

4、 類器官復蘇

(1)取10ml肝癌類器官培養緩沖液B于15ml離心管中

(2)從液氮罐中取出凍存的類器官細胞，快速置于 37℃水浴鍋中融解。

(3)水浴融解過程中，需輕輕搖動冷凍管，以確保凍存液在 1-2 分鐘內w全融解。

(4)將溶解后的類器官細胞快速轉移至15ml 離心管，使用移液管輕輕吹打6-8次，300g 離心 5分鐘，然后除去上清液并收集類器官細胞沉淀。添加適量肝癌類器官緩沖液B重懸移入1.5ml離心管300g離心5min。

(5)基質膠重懸，每孔25μl基質膠鋪在24孔細胞培養板中，放置培養箱中10-15min成膠，添加500μl肝癌類器官培養基A。

運用范圍:

FOR LABORATORY RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES

培養圖片展示:

送樣要求及癌種

樣本的質量將極大影響類器官培養的成功率和效率，因此建議客戶提供的樣本需符合以下幾項要求：