人結(jié)腸癌順鉑耐藥株HCT8/DDP培養(yǎng)手冊(cè)

細(xì)胞名稱(chēng)：人結(jié)腸癌順鉑耐藥株HCT8/DDP　　   

貨號(hào)：WS147（（HCT8）STR鑒定）

規(guī)格：1×10?cells/T25培養(yǎng)瓶

用途：僅供科研使用

一、細(xì)胞介紹

該細(xì)胞為由HCT8細(xì)胞構(gòu)建的耐DDP藥物細(xì)胞株。

二、細(xì)胞特性

1） 來(lái)源：結(jié)腸癌組織

2） 形態(tài)：上皮細(xì)胞樣，貼壁生長(zhǎng)

3） 含量：>1x106  細(xì)胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5)  用途：僅供科研使用。

三、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備

1）詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

  血清我們推薦 FBS500-WP-002

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

四、 細(xì)胞處理

1） 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第二天顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來(lái)終止消化。 

3. 輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說(shuō)明書(shū)要求配置的新的培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

注意：細(xì)胞傳代1~2次后仍能保持增殖，即可提高藥物濃度至0.5ug/mL繼續(xù)培養(yǎng)；若此過(guò)程中細(xì)胞停止增殖，且狀態(tài)較差，則需降低藥物濃度（降低一半藥物濃度）或使用不含藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)，至細(xì)胞密度約8×105個(gè)/mL，且生長(zhǎng)狀態(tài)較好時(shí)，再更換為所需的藥物濃度。

3）細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

下面T25瓶為例；

1. 細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過(guò)程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來(lái)決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml.

1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ，按每1ml凍存液含1×106~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱(chēng)、代數(shù)、日期等信息。

注意：細(xì)胞凍存過(guò)程中，不可添加藥物。

2. 將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過(guò)夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。