“外泌體”的常見問題集錦~

如何鑒定提取出來的外泌體？

以目前外泌體的分離手段很難獲得十分純凈而且單一的外泌體樣品，也沒有任何一個單一實驗可以確定外泌體的存在。根據國際細胞外囊泡協會發表的指導手冊《MISEV 2018》，外泌體特征鑒定通過NTA測粒徑分布、TEM電鏡分析形態、WB檢測標志蛋白三項來驗證。NTA分析樣品中外泌體的粒徑分布和顆粒濃度，TEM電子顯微鏡來觀察樣品中外泌體的形態特征，WB檢測外泌體標志蛋白。

外泌體如何保存？

不同時間、溫度的保存對不同的外泌體樣本影響不一；如果研究方向為外泌體形態特征、蛋白或其他功能性分析，在分離后新鮮使用為最佳。目前主流的建議是提取出外泌體后最好是新鮮使用，或低溫短期保存。

短時間幾天內可以放4°C，長時間儲存置于-80°C保存。

NTA檢測可以進行外泌體定量嗎？

NTA是物理方法，基于顆粒的布朗運動，因為不管是脂質體、蛋白，甚至是PBS中的顆粒（部分實驗室自行配置的PBS中發現大量顆粒，推薦在外泌體研究中，用VC品牌的PBS（P/N:C3580-0500），避免干擾），都會被軟件讀取，并不能分辨是否為外泌體。但NTA提供的粒徑分布可供判斷所提取的內含物是否在外泌體的粒徑范圍內；另外，在做外泌體分泌的對比實驗中，NTA提供的濃度值也可以作為重要的參考數據。

外泌體NTA檢測需要多少量？

Zetaview儀器的最佳檢測區間是10^7 particles/ml，且有濃度檢測下限，為10^5 particles/ml，一般進樣量不少于2 ml；

無法準確建議送樣量，檢測需要量與樣本本身濃度有關，樣本濃，則用量小，反之則多，根據檢測經驗，樣本取用量一般在2 µl-100 µl不等，取用量大于50 µl時大多由于樣本分泌量過低、提取失敗或者對樣本有過多稀釋。

一般建議：送樣量不低于30 µl。

外泌體用什么分離方法比較好？

無法明確哪種分離方法比較好，各有千秋，以下列出常用的外泌體分離方法：

超速離心法（差速離心和密度梯度離心）：操作繁瑣，耗時長，分離外泌體純度較高，但得率低，目前分離外泌體主流方法；

尺寸排阻色譜（Size-exclusion chromatography，SEC）：應用填充多孔聚合物微球的柱子，精確分離大小分子，操作簡便，耗時短，分離外泌體純度較高；

聚合物沉淀法：操作簡便，耗時短，可能會同時分離非囊泡污染物（包括脂蛋白），分離外泌體純度較低；

磁珠免疫法：通過特定的抗體組合從樣本中捕獲不同類型的外泌體，免疫親和技術具有高特異性、可獲得高純度的外泌體、且不影響外泌體形態完整等優點，是富集表征*的外泌體的優選方法。但是此方法效率低，外泌體內含物的生物活性易受pH和鹽濃度影響，不利于下游實驗的進行。

組合方法：如聚合物沉淀法+SEC (CellGS Exo-spin 外泌體純化試劑盒）純化流程溫和，無需高速離心，操作簡便并且產物純度高，分離出的外泌體完好無缺，適用于下游功能研究、WB驗證、RNA分析等。