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    免疫熒光單標(biāo)記和雙標(biāo)記的方法?及千舍熱賣細(xì)胞?

    更新時(shí)間:2022-08-18點(diǎn)擊次數(shù):1741

    免疫熒光單標(biāo)記和雙標(biāo)記的方法

    1. 免疫熒光單標(biāo)記方法

    免疫 熒光單標(biāo)記是指只標(biāo)記一種蛋白質(zhì)分子,方法比較簡(jiǎn)單,只要按照染色步驟去做,通常不存在太多的問題。但要注意固定液的選擇,固定液選擇的合適與否,可能會(huì)直接影響染色結(jié)果。具體染色方法如下。

    1)所需材料與試劑

    (1)培養(yǎng)在蓋玻片或玻璃培養(yǎng)皿中融合程度達(dá)到60%一70%的細(xì)胞。

    (2)一抗、FITC或TRITC標(biāo)記的二抗。

    (3)4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液(一20℃預(yù)冷20min)。

    (4)封閉液。

    (5)0.01mol/LPBS緩沖液。

    2)染色方法

    (1)取出培養(yǎng)有細(xì)胞的蓋玻片或glass―bottom培養(yǎng)皿,用0.01MPBS洗2―3遍

    (2)加入0.3%的TritonX―100,37℃,30rain。

    (3)加入4%多聚甲醛室溫固定30min或冷丙酮4℃固定10min。

    (4)正常阻斷血清1:20封閉室溫20~30min,抑制IgG的非特異性結(jié)合。阻斷血清必須選擇與二抗同一種屬的正常血清。

    (5)去掉正常血清,直接加入一抗,37C孵育1h或4℃過夜。抗體以0.01mol/LPBS稀釋(理想的抗體濃度需經(jīng)試驗(yàn)而定)。

    (6)0.3%TritonX―100洗5min,0.01mol/IPBS洗5min,0.3%TritonX 5min,0.01MPBS洗5rain。

     (7)加入FITC―二抗或TRITC―二抗,37℃,孵育1h。

    (8)0.3%TritonX―100洗5rain,0.01mol/LPBS洗5min,0.3%TritonX 5min,0.01mol/LPBS洗5mln,用濾紙吸干。

     (9)90%甘油(PBS配制)封片。

    (10)激光掃描共焦顯微鏡下觀察,或于4℃避光保存。

     2.免疫熒光雙標(biāo)記方法

    免疫熒光的雙標(biāo)記是指同時(shí)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)兩種蛋白質(zhì)分子,當(dāng)懷疑某種配體與已知受體結(jié)合后可用此方法加以證明。此方法稍微復(fù)雜一些,首先應(yīng)注意所用的一抗必須是來(lái)自不同種屬動(dòng)物的兩種特異性抗體(例如:A抗體為多克隆抗體,來(lái)自家兔;B抗體為單克隆抗體,來(lái)自小鼠)。其次,兩種二抗所帶熒光素的發(fā)射光不應(yīng)重疊,且盡量遠(yuǎn)離,通常可以選擇FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5,或Cy3和Cy5等來(lái)組合。通常情況下,染色時(shí)兩種一抗可以同時(shí)孵育,然后可以同時(shí)孵育兩種二抗。但當(dāng)染色結(jié)果一種顏色非常弱,而另一種顏色比較強(qiáng)時(shí),應(yīng)考慮先孵育顏色較弱的二抗。其他步驟同免疫熒光單標(biāo)記。

    3,樣品制備注意事項(xiàng)

    (1)在進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記時(shí),如樣品的來(lái)源為組織,應(yīng)采用冷凍切片。

    (2)樣品制備應(yīng)滿足一般熒光顯微鏡觀察的要求

    (3)盡量去除非特異性熒光信號(hào)。細(xì)胞經(jīng)熒光染色后可能會(huì)產(chǎn)生自發(fā)熒光,可用PBS取代一抗作為對(duì)照,以區(qū)分自發(fā)熒光和陽(yáng)性結(jié)果。

     (4)為了不將細(xì)胞壓扁,蓋玻片與載玻片之間的介質(zhì)多用甘油與PBS混合液(9:1)封片,甘油還有抗熒光淬滅的作用。同時(shí)還應(yīng)注意封片時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。

     (5)用指甲油將蓋玻片四周封片,注意避免將細(xì)胞壓扁。

     (6)為防止熒光淬滅,可在介質(zhì)中加入抗氧化劑DABCO(100mg/mi),室溫,密封可保存6個(gè)月;或苯二胺(100mg/mi),-20℃,保存2~3周。

    蘇州千舍熱賣熒光標(biāo)記細(xì)胞:

     人肺癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 A549+luc

     人膽囊癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 GBC-SD+LUC

    人永生化表皮細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 HACAT+LUC

    人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 HCC827+LUC

    人結(jié)腸癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 HCT116+LUC

    人宮頸癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 HELA+LUC  

    人胃癌細(xì)胞黃色熒光標(biāo)記 HGC-27+YFP

    人結(jié)直腸癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 LOVO+LUC

    人乳腺癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 MCF-7+luc

    人乳腺癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 MDA-MB-231+LUC

    人高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 MHCC-97H+luc

    人胃癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 NCI-N87+LUC

    人皮膚黑色素瘤細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 SK-MEL-2+LUC

    人卵巢癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 SK-OV-3+LUC

    人類星形膠質(zhì)瘤耐替莫唑胺細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 U251 MG/TMZ+LUC(3000)

    人乳腺癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 ZR-75-1+luc

    小鼠乳腺癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 4T1+luc

    小鼠黑色素瘤細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 B16-F10+LUC

    小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 CT26+LUC

    小鼠膠質(zhì)細(xì)胞瘤熒光素酶標(biāo)記 GL-261+luc

    小鼠肝癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 HEPA1-6+LUC

    小鼠卵巢上皮癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 ID8+LUC

    小鼠骨肉瘤成骨細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 K7M2WT(K7M2-WT)-LUC

    小鼠肺癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 LLC+LUC

    小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 MC38+LUC

       小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 neuro


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