小鼠結腸癌細胞穩定表達熒光素酶，CT26+luc
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小鼠結腸癌細胞穩定表達熒光素酶，CT26+luc

細胞介紹：

CT26細胞是被N-亞硝基-N-甲基脲烷（NNMU）誘導得到的未分化的小鼠結腸癌細胞，該細胞的一個克隆形成的細胞系被命名為CT26.WT。CT26.WT被逆轉錄病毒載體LXSN穩定轉化形成了一個致死性的亞克隆CT26.CL25，這一病毒載體含有lacZ基因、編碼腫瘤相關抗原（TAA）和beta半乳糖苷酶。CT26.WT和CT26.CL25細胞在小鼠中生長速度和致死率都很相似，不同的是CT26.CL25細胞可以表達腫瘤相關抗原和beta半乳糖苷酶，因此這兩株細胞可以聯合用于免疫和宿主免疫反應的研究。該細胞通過慢病毒轉染的方式攜帶Luc基因。

細胞特性

1） 來源：小鼠結腸

2） 形態：成纖維細胞樣，貼壁生長

3） 含量：>1x10⁶  細胞數

4） 規格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5)  用途：僅供科研使用。

細胞篩選：

該細胞為穩定轉染Luc的細胞，隨細胞傳代次數的增加，其Luc熒光強度會逐漸減弱。若實驗要求需要維持熒光強度，可以加入嘌呤霉素進行再次篩選。 建議收到細胞后至少傳3代，凍存留種后再進行篩選。

初次進行細胞篩選時，建議加入終濃度為1ug/ml嘌呤霉素的*培養基維持培養，若無細胞漂浮或者漂浮較少，即可更換為含2ug/ml嘌呤霉素的*培養基繼續篩選，以此類推，至最高藥物濃度為5ug/ml。若篩選過程中，漂浮細胞大于60%，則停止篩選，換成正常培養基培養，至細胞密度約80%，可繼續加入同濃度嘌呤霉素進行篩選。當加入5ug/ml嘌呤霉素時細胞正常增殖，可停止篩選，用不含藥*培養基正常培養。

運輸和保存：干冰運輸及復蘇好存活細胞：（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉入液氮或直接復蘇，若發現干冰已揮發干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯系。（2）T25瓶復蘇的存活細胞常溫發貨，收到后按照細胞接收后的處理方法操作。

細胞接收后的處理：

1）收到細胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養箱放置約2-3h，若發現培養瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯系我們。

2）請在4或5X顯微鏡下確認細胞狀態，同時給剛收到的細胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細胞狀態的依據。

3）貼壁細胞：細胞在37℃培養箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況。若鏡下觀察細胞的生長密度若在60%以下，可去除培養瓶中灌液培養基（若有未貼壁的細胞需要離心回收，重懸打入到原培養瓶中）,加入新配制的*培養基6-8mL，放到細胞培養箱中繼續培養。若細胞生長密度達70%-80%以上，可以對細胞進行傳代處理。傳代過程中，若因運輸振動脫落的細胞需要離心回收。

4）備注：運輸用的培養基（灌液培養基）不能再用來培養細胞，請換用按照說明書細胞培養條件新配制的*培養基來培養細胞。  收到細胞后第一次傳代建議T25培養瓶1：2傳代 。

一．培養基及培養凍存條件準備：

1） 準備RPMI-1640培養基；優質胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。

二．細胞處理：

1） 凍存細胞的復蘇：：

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL*培養基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，*培養基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml*培養基的培養瓶（或皿）中37℃培養過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法：

1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養基來終止消化。 

3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的*培養基以保持細胞的生長活力，后續傳代根據實際情況按1:2~1:5的比例進行。

3）細胞凍存: 收到細胞后建議在培養前3代時凍存一批細胞種子以備后續實驗使用。下面T25瓶為例；

1. 細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數板計數，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×10⁶~1×10⁷個活細胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞 ，按每1ml凍存液含1×10⁶~1×10⁷個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱、代數、日期等信息。

3. 將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續查閱和使用。

小鼠結腸癌細胞穩定表達熒光素酶，CT26+luc 

注意事項：

1. 所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2. 建議在復蘇凍存細胞時始終使用防護手套、衣服和戴上防護面罩。注意：凍存管浸沒在液氮中會泄漏，并會慢慢充滿液氮。解凍時，液氮轉化成氣相可能導致容器爆炸或用危險力吹掉其蓋子，從而產生飛揚的碎屑造成人員傷害。

★ 我們需要知道都有哪些種類的牛血清和它們的用途：

1、透析血清

分子量小于10,000的分子如氨基酸、葡萄糖、鹽離子和未結合的蛋白均被移除。透析血清主要用在進行營養成分優化和標定特定成分進行研究的實驗中。

2、碳吸附血清

使用活性和右旋糖苷去除血清中的親脂類(lipophilic)物質，如某些激素、細胞因子、生長因子等，去除作用對分子量大小并無區分。碳吸附胎牛血清常用于體外培養研究驗證激素的作用效果。

3、去外泌體血清

適用于收集細胞分泌的外泌體時使用。

4、低IgG血清

用于研究抗體、病毒和病毒反應、細胞表面抗原表位。

5、四環素血清

應用于使用敏感四環素誘導表達系統的細胞培養(Tet-on, Tet-off)，以及其它對四環素敏感的實驗中。

6、IR (輻照)

鈷60伽馬輻照劑量在3.5Mrad. 通過直接與間接作用將生物大分子（如核酸）鍵結破壞，人畜用藥物/疫苗，及對微生物負荷(Bioburden)要求水平的實驗。

7、HI (熱滅活)處理血清

56℃, 30Min, 破壞補體，確保細胞與抗體結合不會發生裂解。

8、胚胎干細胞（ES）專用血清

是從多個批次的胎牛血清篩選出特定批號，適用于人及小鼠胚胎干細胞、成體干細胞及原代細胞長期培養。

9、間充質干細胞（MSC）專用血清

從多個批次的胎牛血清篩選出特定批號，經過骨髓，脂肪組織及臍帶來源的間充質干細胞的細胞活性嚴格測試，通過傳代及分化比例測試。

其他動物血清

10、馬血清

10%馬血清可代替FBS用于支持SRBC的體外抗體應答, 常與牛血清結合或單獨作為哺乳動物細胞培養的補充培養基。

11、豬血清

豬血清在染色體研究中表現非常出色，可用于淋巴細胞培養, 疫苗生產（生產支原體）, 中和脂質體包裹的腺相關病毒（AAV）, 用于誘導大鼠肝纖維化, 作為酶聯免疫吸附試驗（ELISA）中的標準陰性參考。

12、兔血清

正常兔血清可作為免疫分析的阻斷劑和對照。在免疫組織化學和免疫細胞化學方面，各種研究均采用20%或1:200稀釋兔血清作為阻斷劑。

13、羊血清

用于生物醫學研究的大多數細胞系和原代培養物上，FBS的合適替代物，病毒分離和鑒定，病毒學研究。

用作魚類細胞培養的有效NBCS替代物。

可成功地代替胎牛血清在生長培養基中長期用于環孢蘑菇的體外繁殖。