細胞傳代操作步驟

一、   貼壁細胞傳代（以一個T25瓶為例）

1、 吸出原培養液；

2、 加入2ml左右PBS，輕輕晃動培養瓶潤洗細胞，吸出PBS丟棄；

3、 加入1ml左右胰酶，輕輕晃動培養瓶使之浸潤所有細胞，放入培養箱消化；

4、 消化時間跟據細胞特性有所不同，顯微鏡下看到細胞塊中間的細胞明顯分離變圓，側立培養瓶細胞可以滑落時可終止消化，全程不要拍打培養瓶；

5、 加入3ml含血清的培養基終止消化，吹打細胞使之脫落并在液體里反復吹打使細胞，使之盡量呈單顆細胞的懸浮液，這時可以在顯微鏡看下；

6、 收集細胞懸液離心，1200rpm（約250g） 3分鐘，離心完吸出上清丟棄。

7、 加入新鮮培養基，吹打幾下混勻細胞即可，按需接種到新培養瓶，補足培養基，擰松瓶蓋或使用透氣瓶蓋進行培養。

8、 檢查培養箱二氧化碳，溫度和水盤。

二、   懸浮細胞傳代（以一個T25瓶為例）

1、 輕輕吹散懸浮細胞，部分貼壁松散的懸浮細胞可直接吹打培養瓶底部使細胞懸浮，收集細胞懸液到無菌離心管中，離心1200rpm（約250g） 3分鐘，離心完畢吸出上清丟棄;

2、 加入適量新鮮培養基重懸細胞，按比例接種至培養瓶（接種比例按實際情況，不確定可計數后再接種）;

3、 常規細胞推薦以3~5×10⁵cells/ml傳代，長到2×10⁶cells/ml傳出;

4、 建議剛開始幾代計數后傳代，后面可以根據經驗按比例傳代。

三、     半貼壁半懸浮細胞傳代（以一個T25瓶為例）

1、 培養液（含懸浮的細胞）：用移液器吸出培養液轉移到無菌離心管中；

2、 貼壁部分：用1ml PBS洗細胞，吸出PBS放入到第1步裝有培養液的離心管中收集（不要直接丟棄，里面有細胞）；

3、 培養瓶加入胰酶1ml，放入培養箱靜置消化；

4、 消化時間跟據細胞特性有所不同，顯微鏡下看到細胞明顯收縮變圓，側立培養瓶細胞可以滑落時可終止消化，全程不要拍打培養瓶；

5、 用3ml含血清的培養基終止消化，將消化下來的細胞懸液吹散細胞后收集到第1步的離心管；

6、 將離心管在1200rpm（約250g） 3min離心，離心完畢棄掉上清，加入新的培養基重懸，按實際情況分瓶，放入培養箱培養。

溫馨提示：

1、 每丟棄一個液體前都要想一下里面有沒有可能有細胞，避免丟失細胞。

2、 細胞種類、細胞密度、細胞狀態、甚至胰酶的品牌，均影響到細胞的消化時間，所以消化的時候不要只看時間，以顯微鏡下細胞的狀態來確定消化終點，部分難消化的細胞消化時間甚至可以長達15分鐘。

3、 細胞的傳代比例通常說的是等體積的容器，不同容器需要換算；例如：一個T25培養瓶的細胞傳到一個10cm培養皿里面，雖然是1傳1，但是比例可不是1:1；T25瓶底面積25cm2，10cm培養皿底面積約為55cm2（10cm的培養皿指的是培養皿的外徑，而培養皿的內徑約為8.4cm，故根據內徑可求出其底面積為55cm2），所以實際傳代比例為1:2.2。

4、 在有關離心機的實驗中，標準的離心條件應該是用RCF(relative centnifugal fieldt)來衡量，而在實際大家實驗過程中，往往習慣用rmp即每分鐘轉速來表示；RCF即表示相對離心場，以重力加速度g(980.66cm/s2)的倍數來表示；RCF=1.119×10-5×(rpm)2×r（其中r表示離心機轉軸中心與離心管中心的距離，單位為cm）；所以每個實驗室離心機轉速設置是不一樣的，常規建議1200rpm 大約250g。